La película comienza con una secuencia de acción que Andy imagina a la hora de jugar en la que Woody, Jessie, Tiro al Blanco y Buzz se ven en la obligación de detener los planes del malvado Dr. Tocino (quien es Hamm), el Sr. y la Sra. Cara de Papa y el trío de aliens de Pizza Planeta.
8 años después de los acontecimientos de Toy Story 2, en 2007, Andy, de 18 años de edad, se prepara para ir a la universidad. Woody, Buzz Lightyear y el resto de los juguetes se preocupan por un futuro incierto puesto que deben aceptar la dura realidad de que Andy su dueño ya no es un niño y que ha dejado de jugar con ellos desde hace mucho tiempo, algunos amigos de Buzz y Woody ya no están con ellos (entre los cuales se encontraba Betty, la ex-novia de Woody), debido a accidentes, ventas de jardin y pérdidas. Por si fuera poco, las cosas se intensifican tan pronto cuando la madre de Andy empieza a organizar una nueva donación, esta vez con destino a Sunnyside, una guardería, ofreciéndole tanto a Andy como a Molly que donen unos juguetes suyos. Mientras que Molly empaca unos cuantos juguetes musicales y a su Barbie. Por otra parte, Andy escoge de entre todos sus juguetes a Woody para llevarlo a la universidad con él y empaca al resto en una bolsa de basura para llevarlos al ático de la casa.
Sin embargo, justo cuando Andy se encontraba cerca de guardar sus juguetes, se ve en la obligación de ayudar a su hermana menor a empacar, dejando la bolsa sola causando que su madre piense que es basura y decide desecharla. Los juguetes, creyendo que Andy sólo quería deshacerse de ellos, logran escapar antes de que el camión de basura llegue a ellos y toman la decisión de marcharse a la guardería. Woody, que vio todo el suceso de la bolsa de basura, consigue llegar con el grupo e intenta informarles de la terrible equivocación que se produjo. Sin embargo los juguetes, convencidos erróneamente de que su dueño ya no los quiere, se introducen en la caja de Sunnyside obligando al vaquero a ir con ellos hasta la guardería.
Una vez en la guardería los juguetes de Andy reciben una calurosa bienvenida por parte de los juguetes de Sunnyside, liderados por el oso Lotso quien les muestra todo el lugar. Los juguetes de Andy, maravillados, se convencen inmediatamente de su nuevo hogar, debido a que generaciones y generaciones de niños estarán jugando con ellos, viviendo sin la preocupación de ser desechados. Woody, por su parte, no se siente cómodo y continúa insistiendo en que le pertenecen a Andy y deberían regresar con él. Los otros insisten en quedarse, por lo que Woody decide abandonarlos y regresar solo con Andy. Poco después de que Woody los deja, los demás juguetes descubren que los niños que Lotso les había asignado en la Sala Oruga para que jugaran con ellos son demasiado pequeños e hiperactivos, razón por la cual al jugar con ellos los maltratan hasta un grado que los torturan y deterioran.
Más tarde, indignados por la situación, Buzz sale de la Sala Oruga en representación de él y sus amigos para buscar a Lotso y decirle que los niños que les asignaron para jugar no tienen la edad indicada para hacerlo y los ubiquen en una sala mejor. Cuando llega, se encuentra a Ken y a otros juguetes de la Sala Mariposa (la Sala Mariposa en el que estaba Lotso) apostando al póquer usando baterías, piezas y dinero de Monopoly como si de asuntos monetarios se tratase y escucha que sólo tienen intenciones de lo peor para él y sus amigos. Al ver esta delicada situación es soprendido y atrapado por Ken y los demás juguetes, Buzz decide confrontar a Lotso para una reubicación a la Sala Mariposa, el cual sólo tenía niños "mayores". Sin embargo, Buzz descubre que los juguetes de la Sala Mariposa se tratan de unos egoístas y malvados juguetes que le desean lo peor a los juguetes de Andy y lo apresan y reprograman a su modo demostración, regresandolo a creer que es un guardian espacial. Mientras Buzz va con Lotso, la Sra. Cara de Papa ve a Andy buscándolos desesperadamente a través de uno de sus ojos, que había perdido en la casa, y aparentemente seguía estando en su habitación dándose cuenta que Woody tenía razón, de que “sí iba a poner los Juguetes de Andy en el ático” y Andy los quería después de todo, deciden regresar con él inmediatamente. En ese momento Lotso y sus secuaces (entre los que se encuentra Buzz, manipulado por Lotso) entran en la Sala Oruga y le explican el malentendido y su decisión de volver, pero Lotso se los impide y colocan a todos los juguetes en canastas que son como celdas y les trae a Buzz reprogramado como guardián espacial, con el fin de vigilarlos debido a la fuga de Woody y para evitar que escapen.
Mientras tanto, Woody que no consiguió llegar muy lejos, debido que una niña llamada Bonnie lo encontró y se lo llevó a su casa. Esa noche Woody con la ayuda de los juguetes de Bonnie, consigue ubicar la casa de Andy y descubre que está muy cerca (doblando la esquina). Cuando está a punto de irse, Woody les menciona que viene de Sunnyside y los demás juguetes sorprendidos le preguntan cómo logró escapar y es cuando le revelan que Sunnyside es en realidad una prisión de juguetes, controlada déspotamente por Lotso. Risas, un juguete payaso de Bonnie y ex-amigo de Lotso, le cuenta a Woody que ambos habían pertenecido a una niña llamada Daisy y Lotso había sido su juguete favorito e inseparable, pero un día se volvió amargado y malvado luego de que su dueña los perdiera por accidente y reemplazado por otro oso de peluche similar a él, tiempo después de ser abandonados llegaron a Sunnyside e inmediatamente Lotso se apoderó del sistema y lo corrompió por completo. Luego Woody le pregunta a Risas como logró escapar de la guardería y este le revela que fue debido a que un día se rompió y Bonnie lo encontró y se lo llevó a su casa consigo, revelando además de que muchos otros juguetes de Sunnyside no han tenido la misma suerte que él y que los juguetes nuevos no tendrán ninguna oportunidad contra Lotso. Dándose cuenta de que sus amigos está corriendo peligro, Woody decide regresar a rescatarlos a pesar del riesgo que implica volver.
A la mañana siguiente, Woody regresa a Sunnyside en una mochila de Bonnie y trata de planear una ruta de escape y mientras observa como sus amigos son torturados hasta sus límites en la Sala Oruga por los niños pequeños, un juguete telefonito lo descubre pero en vez de delatarlo, le advierte que hizo mal en regresar, pero luego le revela todos los puntos claves de seguridad que Lotso ha puesto por toda la guardería para que nadie pudiera escapar, ya que después de su escape anterior doblaron la seguridad y luego le menciona la única vía de escape que tienen es la puerta con conexión para el contenedor de basura, pero le advierte que tal vez puedan subir las paredes y burlar a los guardias, pero no se deshacen del mono (quien tiene acceso a las cámaras de seguridad por las noches) no podrán salir. Después logra reunirse con sus amigos y se reencuentran felices, y todos juntos formulan un plan para escapar de la guardería y regresar a su casa antes de que Andy se fuera a la universidad. Durante su escape, atrapan a Buzz y con la ayuda de Barbie (que ayudó a consiguirles el manual), tratan de regresarlo a la normalidad, pero accidentalmente lo configuran al idioma español desarrollando una personalidad que no corresponde con la suya.
Luego de un plan muy complejo ideado por Woody, en donde se ponen en práctica todas las habilidades de los juguetes, estos consiguen llegar a una puerta conectada al basurero de la guardería, que es la única salida y una vez fuera cuando creen haberlo logrado, Lotso y sus secuaces aparecen y habían descubierto el plan de Woody, luego de obligar al telefonito a revelarlo todo. Los juguetes de Andy señalan que Lotso usa a los juguetes de Sunnyside sólo porque él había sido reemplazado y Woody les dice a todos la verdad de su dueña y le dice que le dio el cariño que un niño(a) pudiera dar a un juguete; oyendo esto, sus secuaces cambian de opinión y Bebote (que también había pertenecido a Daisy y a quien le había estado mintiendo desde aquel entonces) arroja a Lotso al basurero. Los juguetes de Andy pasan por encima de la tapa del contenedor de basura, pero uno de los aliens del trío de Pizza Planeta se queda atorado contra la puerta. Al intentar ayudarlo, Woody es arrastrado por Lotso a la basura. Los juguetes de Andy, a excepción de Barbieque se queda con Ken, van a su rescate, y un camión recolector de basura los atrapa. En el camión, a Buzz le cae encima un televisor mientras salvaba a Jessie (de quién se enamoró en su modo español) de ser aplastada por la basura y lo devuelve a la normalidad dejando de actuar como español. Los juguetes son llevados a un basurero y en el momento de llegar, los aliens de Pizza Planeta son arrastrados por un camión gigante. El grupo, luego de observar a sus amigos irse, cae arrastrado por otro camión a un agujero en el suelo, allí una placa móvil de metal lleva a los juguetes a una trituradora. Desesperados, observan que los objetos metálicos se "salvan" de la trituradora al ser atraídos magnéticamente al techo con un magneto, pero llegan a una nueva placa metálica que los conduce a una fundidora para el reciclaje del metal. Encuentran a Lotso y lo salvan de destrozarse en la trituradora, pero en la fundición, después de ayudarlo para que pueda alcanzar el interruptor que apague la banda que los está arrastrando hacia el fuego, este los traiciona y huye sin ayudarlos.
A pesar de sus desesperados intentos de salir del lugar, cuando están cayendo directo hacia el fuego, ya no pueden seguir luchando, entonces los juguetes se toman de las manos, rendidos, listos para ser incinerados. Sin embargo y afortunadamente, los aliens de Pizza Planeta, vivos, manipulan una garra gigante de metal, con la que logran sacar a los juguetes de la fundidora y los colocan a salvo; enfurecidos por la traición de Lotso deciden buscarlo para poder ajustar cuentas, pero Woody sugiere no hacerlo ya que según él "no lo vale". Mientras tanto, uno de los trabajadores del basurero encuentra a Lotso, quien trataba de escapar temeroso de los otros juguetes que traicionó y lo ata al frente de su camión de basura, para gran descontento suyo, mientras otros peluches ya atados le dan la bienvenida a su nuevo y horrible lugar.
Los juguetes se esconden en otro camión de basura, que los lleva de regreso a la casa de Andy. Los juguetes, ya listos para ir al ático se comienzan a despedir de Woody mientras él entra a la caja de la universidad. Sin embargo, pensando mejor la situación decide que él y sus amigos juguetes merecen un destino mejor que ser confinados en el ático, por lo que le deja una nota a su dueño con la dirección de la casa de Bonnie. Haciendo caso a la nota, Andy conduce hasta donde indica la dirección y empieza a regalar sus juguetes a Bonnie presentando a cada uno con su nombre y sus características desde Jessie hasta Buzz. Creyendo haber terminado Bonnie se acerca a la caja de los juguetes y ve a Woody diciendo: "¡Mi vaquero!" para asombro de Andy que no sabe como es que Woody llegó hasta ahí. Cuando Bonnie está a punto de agarrarlo, Andy se lo niega. Tras un muy emotivo momento, luego de observarlo unos cuantos segundos, se lo presenta de la misma forma como presentó al resto de los juguetes, y se lo regala declarando: "Él fue mi amigo desde que tengo memoria, es valiente como tiene que ser un buen vaquero, listo y gentil, pero lo que hace especial a Woody es que jamás te va a abandonar; él estará contigo pase lo que pase."
Andy juega por última vez con sus juguetes y con Bonnie y se despide de todos ellos diciendo "Gracias chicos". Todos lo observan irse y Woody le dice "¡Adiós, vaquero!" mientras al igual que él, todos sus amigos se muestran tristes por despedirse de Andy pero también felices por su nuevo hogar y se presentan con los juguetes de Bonnie.
En los créditos se muestra que mientras todo es feliz para Woody y sus amigos en su nuevo hogar, los juguetes de Sunnyside transforman la guardería en un nuevo lugar agradable, ya libres de Lotso. Con Ken y Barbie al mando el lugar que lo han transformado en todo un sitio de retiro digno para juguetes donados o abandonados, los cuales reciben una atención excepcional desde una bienvenida calurosa en ambas salas, hasta verlos trabajando en equipo para mantener a los niños de la Sala Oruga ocupados: mediante un sistema de turnos, los juguetes permiten que los niños de la Sala Oruga los maltraten y luego de un rato los tiren, momento que aprovechan para esconderse en un lugar seguro en el que además son tratados para que se recuperen, mientras otro grupo de juguetes se presta para pasar por lo mismo, manteniendo a los niños constantemente ocupados. Mantienen al tanto a Woody y sus amigos a través de cartas de su nuevo amigo Ken y de su anterior compañera Barbie. Risas recupera de poco en poco su sonrisa y los sargentos que huyeron de la casa de Andy ahora también están en Sunnyside encargándose de la protección y vigilancia.
En la parte final, los nuevos juguetes de Bonnie celebran su nuevo hogar con Buzz y Jessie bailando la nueva versión en flamenco de la banda sonora principal de la película "Hay un amigo en mí".
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